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非瘟试剂盒

发布时间:2019-07-26 信息来源:

非瘟中盒5副本.png


非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒说明书

【兽药名称】

  通用名:非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒

  商品名: 无

  英文名:African swine Fever Virus (ASFV) PCR Fluorescence Fast Detection Kit

【用途】

  本试剂盒适用于检测病料核酸中的非洲猪瘟病毒(ASFV)DNA,检测结果可用于非洲猪瘟病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

  本试剂盒利用针对非洲猪瘟病毒核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针,配以PCR反应液等组分,在荧光定量PCR仪上,应用实时荧光定量PCR检测技术,通过荧光信号的变化实现非洲猪瘟病毒 DNA的快速检测。

PCR检测体系含有阳性内对照(内标),通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物,避免PCR假阴性。

【主要组成成份】

序号

试剂名称

规格与装量

主要成分

1

ASFV-酶混合液

100μl/管×1管

DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶

2

ASFV-内标

50μl/管×1管

含内标基因片段的克隆质粒

3

ASFV-核酸释放剂

250μl/管×1

SDSTE

4

ASFV-PCR反应液

950μl/管×2管

引物、探针、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液

5

ASFV-阴性对照

50μl/管×1管

灭菌生理盐水

6

ASFV-阳性对照

50μl/管×1管

含目标序列的克隆质粒

  备注:1)不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。

【适用仪器】

  适用于ABI7500荧光PCR仪、SLAN-96P、SLAN-24P荧光PCR仪等。

【样本要求】

  1.适用样本类型:血清、血浆、组织匀浆液上清等。

  2.样本保存和运送:长期保存请置于-20℃以下。标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

【检验方法】

  1  试剂准备(在试剂准备区进行)

  1.1 取出试剂盒中的各组分,室温放置,待其温度平衡至室温,混匀后备用;

  1.2 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量,按比例(反应液38μl/人份+酶混合液 2.0μl/人份+内标1.0μl/人份)取相应量的反应液、酶混合液及内标,充分混匀成PCR-mix,瞬时离心后备用。

  2  样本处理与加样(在样本处理区进行)

  2.1  加样

  2.1.1每个PCR反应管中加入核酸释放剂5μl(建议深吸浅打,避免出现气泡),然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各5μl,吸打3-5次混匀(轻轻吸打,避免出现气泡);室温静置10分钟以上。

  2.1.2每管加入PCR-mix 40μl,吸打混匀2-3次,盖上管盖(去除气泡后),2000rpm离心30 秒。

  3  PCR 扩增(请参照各仪器使用说明书进行设置)

  3.1 将PCR反应管放入扩增仪样品槽,按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及未知样本,并设置样本名称。

  3.2 荧光检测通道选择:

  3.2.1 SLAN 、ABI、Stratagene系列仪器:

  选择FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:none)检测ASFV-DNA;2)选择HEX 或VIC通道(Reporter:HEX/VIC, Quencher:none)检测内标;3)参比荧光(Passive Reference)设置为none。设置Sample Volume为50。

  3.3 循环参数设定(SLAN 24等具备12℃升降温的仪器可执行FAST程序):

步骤

常规程序

FAST程序*

温度

时间

循环数

温度

时间

循环数

1

UNG 酶反应

50℃

2 分钟

1

2

Taq 酶活化

95℃

2 分钟

1

95℃

2 分钟

1

3

变性

95℃

15

40

95℃

3

40

退火,延伸,荧光采集

60℃

30

60℃

20

4

仪器冷却

25℃

10

1

3.3.1 ABI、Stratagene仪器参数设置(*注:由于ABI7500仪器原因,不能设置为30秒,可以设置为31秒或32秒)

4. 结果分析(请参照各仪器使用说明书进行设置,以下分析以ABI系列仪器为例)反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整,Start值可以在3~15、End值可设在5~20,调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analyze进行分析,使各项参数符合下述“5. 质量控制”中的要求,然后到Plate窗口下记录Ct值。

  5. 质量控制

  5.1 ASFV-阴性对照:Ct值无显示;但内标检测为阳性,且Ct值≤40。

  5.2 ASFV-阳性对照:Ct值≤35。

  5.3 以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。

【参考值(参考范围)】

  通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为39,检测内标的Ct参考值为40。

【检验结果的解释】

  1  阴阳性判断:

  1.1 对于测定Ct值≤35的样本,报告为ASFV- DNA阳性;

  1.2 对于测定35≤Ct值<40的样本,报告为ASFV- DNA可疑,需对该样本复测,若Ct值≤40,报告为ASFV- DNA阳性,若Ct值>40,报告为ASFV- DNA低于试剂盒检测下限。

  1.3 对于测定Ct值>40 的样本,同时,内标检测为阳性(Ct值≤40),报告注明ASFV- DNA低于试剂盒检测下限;若内标Ct值> 40或无显示,则该样本的检测结果无效,应查找并排除原因,并对此样本进行重复实验(若重复试验的检测结果仍无效,请与本公司联系)。

检测方法的局限性】

  样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关,其中任何失误都将会导致结果不准确。如果样本处理时没有控制好交叉污染,可能出现假阳性结果。

【产品性能指标】

  本试剂盒检测企业工作参考品,阴、阳性符合率均为100%;精密度试验表明批内和批间重复性好,检测结果Ct值的变异系数均<10%,浓度值变异系数均<50%;本试剂盒最低检出量为4.00E+02 copies/mL;

【注意事项】

  1. 本品仅用于兽医诊断使用,使用前请仔细阅读本说明书。

  2. 试验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项,对每次实验进行质量控制。

  3. 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范,实验人员必须进行专业培训,实验过程严格分区进行,所用消耗品应灭菌后一次性使用,实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备,各区各阶段用品不能交叉使用。

  4. 所有检测样品应视为具有传染性物质,实验过程中穿工作服,戴一次性手套并经常替换手套以避免样品间的交叉污染;样本操作、废弃物处理均需符合相关法规要求:《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。

  5. 所有的试剂在使用前,均需在室温下充分融化、混匀后使用。

【规格】50反应/盒

【储存条件及有效期】试剂应避光密闭储存于-20±5℃;试剂盒有效期为12个月,避免反复冻融。

【生产企业】吉林和元生物工程股份有限公司



更新时间:2019-07-26

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